- 核酸檢測革命：可替代PCR的犀利技術——RPA
- 點擊次數：5171 更新時間：2016-04-28
自PCR技術誕生以來已經有三十年了，從經典PCR、實時定量PCR再到現在的數字PCR，這一技術在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。很多人的實驗根本離不開PCR。筆者曾經也接觸PCR很長一段時間，加樣、設置程序、等待、檢測。這些過程看起來容易，但實驗結果卻總是會出人意料，很多時候根本不知道是哪里出了錯。那么要是有一款技術，它比PCR更快速、便捷、，你會感興趣嗎？
RPA是什么？
基本原理
重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。RPA技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，*反應溫度在37°C左右。
重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物。
圖片來源：Isothermal amplified detection of DNA and RNA
引物設計
RPA分析的關鍵在于擴增引物和探針的設計。PCR引物多半是不適用的，因為RPA引物比一般PCR引物長，通常需要達到30-38個堿基。引物過短會降低重組率，影響擴增速度和檢測靈敏度。在設計RPA引物時，變性溫度不再是影響擴增引物的關鍵因素。RPA的引物和探針設計不像傳統PCR那樣成熟，用戶需要自己摸條件進行優化。
優勢
常規PCR必須經過變性、退火、延伸三個步驟，而PCR儀本質上就是一個控制溫度升降的設備。RPA反應的zui適溫度在37℃-42℃之間，無需變性，在常溫下即可進行。這無疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設備，RPA可以真正實現便攜式的快速核酸檢測。
據介紹，RPA檢測的靈敏度很高，能夠將痕量的核酸（尤其是DNA）模板擴增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約1012擴增產物。而且RPA還用不著復雜的樣品處理，適用于無法提取核酸的實地檢測。
RPA既可以擴增DNA也可以擴增RNA，還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴增產物進行終點檢測，還可以對擴增過程進行實時監控，甚至可以通過試紙條（側流層析試紙條LFD）讀取結果。
RPA可以用來干什么？
RPA對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。以下為大家介紹RPA在細菌、病毒檢測以及癌癥研究等領域的應用情況。
RPA成為致病菌檢測的得力工具
在今年發表的一系列文章中，RPA技術被廣泛用于艱難梭狀芽孢桿菌、結核桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA、淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、沙門氏菌、大腸埃希菌STEC等常見致病菌的檢測。在臨床診斷和食品安全方面，為人們提供了簡單快速的實地篩查方案。（這篇文獻之前報道過，在這里就不詳述了。）[詳細]
RPA技術建立沙眼衣原體快速檢測方法
沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）感染是zui常見的性傳播疾病之一。沙眼衣原體影響5-10%的人口，常見于小于25歲的成年人。目前廣泛使用的沙眼衣原體檢測方法是以聚合酶鏈反應（PCR）技術為基礎，這種方法只適合于經過專業訓練的人員在具有特定儀器的實驗室使用。
日前，發表在《分子診斷雜志》（The Journal of Molecular Diagnostics）雜志上的一項研究中，研究人員利用RPA技術開發了一種檢測沙眼衣原體的快速、靈敏的新方法，利用該方法在20分鐘內即可得出檢測結果。[參考文獻]
研究人員利用RPA技術直接從患者尿液樣本中檢測沙眼衣原體，不需要從尿液樣品提取總DNA，也不需要專門的儀器設備。而且該檢測方法還具有少費力、少耗時、更經濟等特點。與目前的沙眼衣原體檢測方法比較而言，該方法還能夠顯著提高檢測的敏感性和特異性
RPA檢測瘧原蟲
澳大利亞科學家捕捉到瘧原蟲入侵并摧毀人體紅細胞畫面
核酸擴增是目前zui靈敏的瘧原蟲（P. falciparum）特異性檢測法。然而，PCR需要熱循環設備和專業性操作，資源匱乏的地區往往難以滿足這些條件。在這種情況下，與側流層析結合的RPA有著很大的應用前景。
《Malaria Journal》雜志今年三月份發表的一項研究中，研究人員將RPA基礎反應、TwistAmp nfo探針和側流層析結合起來，實現了瘧原蟲18S rRNA基因的高靈敏度快速檢測。在38°C的條件下，只需要不到十分鐘的擴增，就能檢出含有四個瘧原蟲的樣本。加上側流層析的檢測時間，整個流程總共只需要15分鐘，而且肉眼可以直接看到檢測結果。
研究人員用不同瘧原蟲測試了這種方法的靈敏度和特異性。研究顯示，所有瘧原蟲都被成功檢出，所有非瘧原蟲都得出了陰性結果。文章指出，這一方案將大大改善資源匱乏地區的瘧原蟲分子診斷。[參考文獻]
RPA檢測冠狀病毒
2012年在中東鑒定的中東呼吸綜合癥冠狀病毒( Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)是一種新型的冠狀病毒。這種病毒很快傳入了歐洲，給公共安全機構敲響了警鐘。
目前，MERS-CoV檢測主要依賴于實時RT-PCR，需要收集患者樣本然后到專門的實驗室去檢驗。因此，亟需能夠進行實地檢測的快速裝置。
《PLOS Currents：Outbreaks》去年十二月發表的一項研究，開發了一個能在3-7分鐘內鑒定MERS-CoV的便攜式RT-RPA裝置。在42°C條件下，等溫MERS-CoV RT-RPA與實時RT-PCR一樣敏感，可檢出10個RNA分子。文章指出，這個便攜裝置是監控MERS-CoV傳播，尋找其動物宿主的理想方法。[參考文獻]
RPA檢測埃博拉等十種致命威脅
檢測傳染性疾病的綜合panel，有助于資源匱乏地區進行實地分子診斷，對生物防御工作也有很大的幫助。
《Journal of Clinical Microbiology》雜志去年四月的一項研究開發了一個RPA檢測panel，對土拉弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis）、鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis）、炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）、天花病毒進行RPA分析，對裂谷熱病毒（Rift Valley fever virus）、埃博拉病毒、Sudan病毒和馬爾堡病毒進行RT-RPA分析。研究顯示，這些RPA和RT-RPA的分析靈敏度大多在16-21個分子之間（與實時PCR相當），42°C下只需運行6-10分鐘，而且不存在交叉反應。[參考文獻]
RPA檢測HIV
在HIV診治中，即時檢測是非常重要的，對嬰兒來說更是如此。有案例顯示，HIV感染后立刻進行治療就能控制住患者體內的病毒，讓它們無法進行復制。舉例來說，生來就攜帶HIV的密西西比嬰兒，在出生后立即得到了治療。后來這個孩子停藥了兩年多，病毒復制依然得到了控制。
目前嬰兒HIV診斷的金標方法是DNA PCR，但許多地區并不具備這樣的條件。在這種條件下，RPA技術正好可以大展身手。（四篇論文介紹了RPA在HIV檢測中的應用）[詳細]
RPA在癌癥研究中的應用
去年六月，新加坡A*STAR的研究團隊在Lab on a Chip雜志上，發表了一種能夠快速檢測癌癥單點突變的新技術，等溫固相擴增/檢測（ISAD）。這是一種無需標記的實時檢測技術，將基于硅基微環（silicon microring）的固相擴增與等溫重組酶聚合酶擴增（RPA）結合在一起。
去年十月，Talanta雜志上也發表了一項用到RPA技術的癌癥研究。該研究在超靈敏生物條碼分析（BBC）、適配體（aptamer）和RPA的基礎上，開發了一個檢測細胞色素C（Cyto-c）的新生物條碼分析法（ABC）。細胞色素C是細胞死亡的重要標志物。（點擊鏈接查看這兩項研究的詳細報道和文獻）[詳細]
RPA全攻略之疑難解答
說了這么多，你們肯定會有很多疑問，引物怎么設計？RPA反應能實現多重化么?RPA反應能對模板進行定量么? RPA支持生物素或熒光標記的寡核苷酸么? RPA支持生物素或熒光標記的寡核苷酸么?以下就為大家一一解答。
RPA的擴增引物可以說是整個反應的關鍵所在，那么怎樣才能設計好RPA引物呢？引物長度怎樣選擇？引物序列有什么要求？擴增產物長度有何限制？篩選的主要流程？答案詳見《RPA：引物與探針的常見問題》一文。此外，在該文中你還可以找到以下問題的答案。
可以。RPA在同一個管中同時進行多個擴增反應。不過，多重化的引物組合需要精心設計，以便每個引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應的引物總量(nmol)不要超標太多。如果在一個反應中使用兩個以上的擴增引物，就應該控制不同引物的量。另外，我們應當事先考慮好檢測多個擴增事件的探針、設備以及熒光團的兼容性。
可以。擴增子達到可檢出水平的時間，依賴于反應起始時的模板量。初始模板的拷貝越多，擴增子就越快達到可檢出水平。不過，這種定量需要精心的實驗安排，確保對照反應是同時開始的。舉例來說，可以利用鎂離子的添加時間進行控制。因為鎂離子一旦進入體系，RPA反應就會開始。
此外，較慢的擴增過程有助于更的定量。我們可以通過調整反應條件或引物設計來減慢RPA的反應速度。
可以。這樣比較的是反應開始時的熒光和反應結束時的熒光，熒光增強意味著發生了擴增。
支持。在RPA反應中，連有生物素或熒光團的引物與未修飾的引物表現差不多。據悉還沒有發現任何差異。
可以。插入性染料可以在RPA反應中進行定量和監控。不過，這種染料可以結合任何雙鏈DNA，會生成來自引物的假陽性信號。由于RPA擴增在常溫下進行，這種噪音會比PCR嚴重一些。
需要。RPA反應中的物質會干擾瓊脂糖電泳，如果不進行產物回收，跑出來的帶會出現拖尾。
信息來源：http://www.biodiscover。。ｃｏｍ/topic/technology/310.html- 上一篇：RNA抽提技巧（TRIZOL法）
- 下一篇：甲基化分析的常見問題解答
